紫外線交聯(lián)和免疫沉淀 （CLIP）

原則

紫外線（UV）交聯(lián)是RNA生物化學(xué)家用來研究活組織中RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物的經(jīng)典體外工具。科學(xué)家們已經(jīng)成功地使用CLIP（RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物的交聯(lián)和免疫沉淀）來鑒定神經(jīng)元特異性RNA結(jié)合蛋白Nova家族的許多靶RNA。隨著CLIP技術(shù)的發(fā)展，科學(xué)家們正在試行將其與其他幾種感興趣的RNA結(jié)合蛋白一起使用，特別是FMRP和Hu家族。

圖1.CLIP的基本原理。暴露于紫外線時，近端蛋白質(zhì)和RNA之間形成共價鍵。這些鍵只發(fā)生在直接接觸的部位，并保留RNA-蛋白質(zhì)相互作用。

紫外線（UV）暴露后，相鄰蛋白質(zhì)和核酸之間形成共價鍵。基于這一特殊原理，CLIP已被開發(fā)為使用UV測定RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物體內(nèi)交聯(lián)的常用方法。裂解交聯(lián)細(xì)胞后，通過免疫沉淀（IP）分離靶蛋白。為了對逆轉(zhuǎn)錄的特異性引物進(jìn)行測序，RNA接頭被轉(zhuǎn)移到3'末端，放射性標(biāo)記的磷酸鹽被連接到5'末端。使用凝膠電泳和膜轉(zhuǎn)移從游離RNA中分離RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物。然后進(jìn)行蛋白酶K消化以從復(fù)合物中去除蛋白質(zhì)。此步驟在交聯(lián)位點(diǎn)留下肽，從而鑒定交聯(lián)核苷酸。將RNA接頭連接到5'末端后，通過RT-PCR合成cDNA。后一個cDNA核苷酸通過高通量測序鑒定。將讀段映射回轉(zhuǎn)錄組可以識別相互作用位點(diǎn)。

程序

圖2.CLIP測定的工作流程。

1. 組織的紫外線交聯(lián)

從小鼠身上收獲大腦、脊髓或其他靶組織。將組織放在冰冷的HBSS中，直到收獲完成。設(shè)置一個500mL的Stericup，取下纖維素過濾器，然后用200μm尼龍網(wǎng)片制作一個錐形過濾器以替換它。所得細(xì)胞懸液約為100mL，用于10個大腦。接下來，將組織懸液轉(zhuǎn)移到 50mL 管中，并在 4°C 下以 2500g 離心 5 分鐘。 除去上清液并將組織重懸于原始組織體積的約10倍。將懸浮液放入150mm組織培養(yǎng)皿中，并將懸浮液放入紫外交聯(lián)儀照射400mJ / cm2。交聯(lián)時，在組織懸浮液下方使用一盤冰塊以保持懸浮液低溫。

將輻照的懸浮液收集在50mL管中，然后用額外的5mL HBSS洗滌每個板，也收集這種洗滌。在4°C下以2500rpm再次旋轉(zhuǎn)組織5分鐘。 將組織重懸于原始組織體積的2倍，并將溶液移液到管中。短暫旋轉(zhuǎn)試管并取出上清液。在-80°C下冷凍直至使用。

2. 珠子制備

移液 100μL 蛋白 A Dynabead 珠溶液。將磁珠放入磁性支架中，用 500μL 1X PXL 捕獲和清洗磁珠。再重復(fù)洗滌兩次。將磁珠重懸于 100μL 的 1X PXL 中，并加入適量的抗 RNA 結(jié)合蛋白抗體。在室溫下?lián)u動試管30分鐘至45分鐘，使抗體與磁珠結(jié)合。用 1X PXL 清洗珠子三次。

3. 交聯(lián)裂解液檢查

使用 100μL 冰冷的 1X PXL 裂解每 100μL 交聯(lián)細(xì)胞。將裂解物放在冰上10分鐘。向每個試管中加入 10μL RNasin 和 10μL RQ1 脫氧核糖核酸酶;在 37°C 下孵育 15 分鐘。向溶液中加入 1μL RNase T1 儲備液 （1 U/μL）;在37°C孵育10分鐘，以1000rpm振蕩。接下來，在預(yù)冷的微量超速離心機(jī)中以 90K 在 4°C 下旋轉(zhuǎn)裂解物 25 分鐘。

4. 免疫沉淀

對于免疫沉淀，小心地從沉淀碎片中除去上清液，并將上清液添加到一管制備的珠子中。每 300μL 交聯(lián)組織使用約 100μL 磁珠。在 4°C 下?lián)u動珠子/裂解物 1 小時。 用 1mL 冰冷的 1X PXL 清洗 3 次，用 1mL 冰冷的 1X PNK+ 清洗兩次。

5. 激酶免疫沉淀的RNA

將磁珠重懸于80μL 1X PNK+中，加入5μL P32 γ-ATP（γ-腺苷三磷酸）（>3000Ci/mM）和2μL PNK酶。在37°C的熱混合器中孵育，并以1000rpm離心20分鐘。通過加入5μL 1mM ATP完成反應(yīng)。讓反應(yīng)在 37°C 下再繼續(xù) 5 分鐘。 用 1mL 冰冷的 1X PNK+ 清洗珠子四次。將磁珠重懸于30μL 1X PNK+和30μL Novex LDS上樣緩沖液中。

6. SDS-PAGE凝膠和轉(zhuǎn)印

加載 2 孔/管的 Novex NuPAGE 10% 雙三凝膠。在150V下運(yùn)行凝膠，直到染料前沿位于凝膠底部。凝膠電泳后，使用Novex濕轉(zhuǎn)印裝置將凝膠轉(zhuǎn)移到一塊S&S BA-85硝酸纖維素上。轉(zhuǎn)移后，用1X PBS沖洗NC過濾器，并在餐巾紙上輕輕吸干。用保鮮膜包裹膜并暴露在薄膜下。

7. 切出交聯(lián)的RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物

一般來說，RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物以大約蛋白質(zhì)和RNA的總分子量運(yùn)行。使用手術(shù)刀刀片切掉這條帶子，然后將硝酸纖維素切成小塊。將這些碎片放入一個干凈的管子中。

8. RNA分離純化

在1X PK緩沖液中制備4mg / mL蛋白酶K溶液;將該儲備液在 37°C 下預(yù)孵育 20 分鐘以消化任何 RNase。向每管分離的NC片中加入200μL該蛋白酶K溶液;在37°C振蕩（1200rpm）孵育20分鐘。加入 200μL PK/7 M 尿素緩沖液;在37°C振蕩（1200rpm）下再孵育20分鐘。

加入 400μL RNA 苯酚和 130μL CHCl3 溶液。渦旋這些管，然后在37°C下以1400rpm振蕩（1200rpm）孵育20分鐘。接下來，在4°C或室溫的微量離心機(jī)中全速旋轉(zhuǎn)管10分鐘。將每個試管的水相放入干凈的試管中，加入 50μL 3M NaOAc、pH 5.2 和 1mL 的 1：1 乙醇和異丙醇混合物。在 ?20°C 下沉淀過夜。

9. 核糖核酸連接

在冷離心機(jī)中全速旋轉(zhuǎn)RNA30分鐘。用 100μL 75% 乙醇洗滌沉淀，然后在 SpeedVac 中干燥沉淀。通過切倫科夫計數(shù)在閃爍計數(shù)器中計數(shù)RNA。使用 T4 RNA 連接酶進(jìn)行 RNA 連接。

10. 連接RNA的純化

如上所述旋轉(zhuǎn)、洗滌和干燥 RNA 沉淀。通過閃爍計數(shù)器中的Cerenkov計數(shù)檢查RNA回收率。倒入20%變性聚丙烯酰胺凝膠（1：19雙：丙烯酰胺，7M尿素）。將整個連接反應(yīng)重懸于5μL H 2 O和5μL甲酰胺上樣緩沖液中。將重懸的RNA在95°C下加熱5分鐘，然后將整個溶液上樣到凝膠上;使用放射性標(biāo)記的PhiX標(biāo)記物來調(diào)整RNA的大小。

凝膠電泳后，將凝膠放在一塊舊薄膜上，并用保鮮膜包裹。將薄膜放在-80°C下，通常過夜以獲得良好的信號。使用曝光的薄膜，切出大于約65nt的RNA。將凝膠切片放入試管中;加入350μL核酸洗脫緩沖液，用1mL注射器柱塞壓碎;在熱混合器中以 37°C 以 1200rpm 孵育 30 分鐘。用切斷的P1000，將凝膠漿液轉(zhuǎn)移到已添加1cm玻璃預(yù)過濾器的色譜柱中。在微量離心機(jī)中全速旋轉(zhuǎn)色譜柱，取出流通物并將其放入干凈的管中。加入 1mL 1：1 乙醇和異丙醇混合物以及 2μL 糖原（20mg/mL 原液），并在 ?20°C 下沉淀過夜。

11. cDNA 和 PCR

如上所述旋轉(zhuǎn)、洗滌和干燥 RNA;在閃爍計數(shù)器中再次計數(shù)RNA以定量產(chǎn)量。將純化的RNA重懸于9μL H 2 O中，并以5pmol/μL加入2μL DP3。在65°C加熱5分鐘;放松和快速旋轉(zhuǎn)。將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

倒入10%變性聚丙烯酰胺凝膠，并在凝膠上運(yùn)行約10μL的PCR反應(yīng);使用放射性標(biāo)記的標(biāo)記物和放射自顯影凝膠。剪掉大約 60-100nt 的主要波段（如果有的話，還可以切掉 100nt 及以上）。像上面對RNA所做的那樣純化和沉淀DNA，但讓DNA從粉碎的凝膠漿液中洗脫至少4小時。沉淀后，將純化的DNA重懸于5–10μL水中。

12. TOPO克隆和測序

我們又使用了三到四輪PCR（如果您的次PCR產(chǎn)量較低，則可以使用更多）。使用離心柱對反應(yīng)進(jìn)行脫鹽。然后，生成 3' A 端。在72°C孵育20分鐘;放在冰上，立即用于TOPO克隆反應(yīng)。輕輕混合并在室溫下孵育 5 分鐘（儲存 3μL，在 ?20°C 下進(jìn)行天克隆時不使用，以進(jìn)行潛在的后續(xù)轉(zhuǎn)化）。按照 TOPO 克隆試劑盒的建議轉(zhuǎn)化大腸桿菌。像其他測序反應(yīng)一樣對單個轉(zhuǎn)化體進(jìn)行小型制備和測序。

13. 數(shù)據(jù)庫搜索

如果不能識別CLIP標(biāo)簽的親本RNA，那么CLIP實(shí)驗(yàn)就毫無用處。美國生物技術(shù)信息中心 （NCBI） 現(xiàn)在有一個專門的 BLAST 搜索頁面，供那些尋找簡短、幾乎完全匹配的人使用，它非常適合 CLIP 標(biāo)簽識別。

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